UNIVERSIDAD DE PANAMÁ
CENTRO REGIONAL UNIVERSITARIO DE BOCAS DEL TORO
FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES, EXACTAS Y TECNOLOGÍA
ESCUELA DE BIOLOGÍA
INVESTIGACIÓN DE GENÈTICA
"SECUENCIACIÒN DE ADN"
ELABORADO POR: JAVIER RODRÍGUEZ 1-720-1199
ANDRÉS ARIAS 1-719-1784
Estructura General y Secuencia de los Nucleótidos
Los cromosomas del núcleo de cada célula del cuerpo están formados de un material llamado ADN. El ADN (descubierto por Johann Friedrich Miescher) contiene el código maestro que dirige las funciones de la célula.
La molécula de ADN tiene una estructura en forma de escalera de caracol, donde los peldaños están hechos por compuestos químicos llamados bases nitrogenadas.
El ADN y ARN pertenecen a un grupo de sustancias biológicas complejas llamadas ácidos nucleicos, denominados así porque se encuentran principalmente en el núcleo celular, aunque también se localizan en el citoplasma y en algunos organelos citoplasmáticos.
Los ácidos nucleicos son las sustancias biológicas que presentan las moléculas más grandes y complejas en los sistemas vivientes, y son las encargadas de llevar a cabo el control primario de los procesos básicos de todos los seres vivos.
El ADN se había identificado como uno de los componentes químicos de la célula desde 1871, pero su participación en los procesos hereditarios no fue determinada sino hasta 1944.
A mediados de este siglo el científico inglés Maurice WIlkins de la universidad de Londres demostró por medio de la técnica de "Difracción de rayos X ", que las moléculas de ADN los nucleótidos se presentaban acomodados unos sobre los otros. Estudios posteriores evidenciaron también que en cualquier tipo de ADN la cantidad de nucleótidos de Adenina era igual a la cantidad de nucleótidos de Timina y que la cantidad de nucleótidos de Guanina siempre era igual a la de nucleótidos de Citosina; esto aprobaba que en la molécula de ADN los nucleótidos se presentaban en pares.
Basándose en estas evidencias James Watson y Francis Crick, dos científicos de la Universidad de Cambridge, presentaron en 1935 un modelo tridimensional de la molécula de ADN.
Según Watson y Crick una molécula de ADN está formada por dos bandas o cadenas de nucleótidos (unidos por enlaces de puentes de hidrógeno) que se enrollan una sobre otra formando una doble hélice. Estos enlaces se forman cuando las dos cadenas (que corren en sentido opuesto) se enrollan.
Todas las moléculas de ADN presentan el mismo patrón de enlace, pero cada especie tiene secuencia única de base en su ADN. Esta constancia molecular y la variación entre las especies constituyen el fundamento de la unidad y diversidad de la vida.
Los nucleótidos son las unidades estructurales de los ácidos nucleicos. En el ADN y en el ARN participan cuatro tipos diferentes de nucleótidos, estos son:
N. de Guanina, N. de Citosina, N. de Adenina, N. de Timina (Uracilo en el ARN).
En los nucleótidos de ADN participa la pentosa desoxirribosa, mientras que en los nucleótidos del ARN participa la pentosa ribosa.
Los cuatros tipos de nucleótidos tienen sus partes componentes organizadas del mismo modo; pero timina y citosina son pirimidinas, que son estructuras de un solo anillo y adenina y guanina son purinas, que son moléculas más grandes y voluminosas y con estructuras de doble anillo.
Cada nucleótido de una molécula de ADN tiene un azúcar de cinco carbono (pentosa aldosa) y un grupo fosfato unido al quinto carbono de la estructura del anillo. Cada nucleótido también tiene uno de los cuatro tipos de bases nitrogenadas unido al primer átomo de carbono.
El nombre de cada nucleótido va a depender del tipo de base nitrogenada que participa en su formación.
La longitud ultravioleta de los rayos solares, las lámparas bronceadoras y otras fuentes de radiación no ionizante puede ocasionar cáncer de la piel. por ejemplo, promueven la formación de enlaces covalentes entre dos bases vecinas de timina en una cadena del ADN. Como resultado se forma una estructura anormal y voluminosa en una molécula de ADN llamado dímero de timina. los dímeros de timina se acumulan en las células cutáneas y pueden desencadenar la aparición de cánceres alterando los controles genéticos normales de crecimiento y división celular.
Secuenciación
Un procedimiento denominado secuenciación de ADN permite determinar el orden preciso de bases nucleótidas (secuencia) de un fragmento de ADN. La secuenciación es el proceso por medio del cual se3 determina el orden exacto de las cuatros bases A, T, C, G del genoma de un organismo o de cualquier fragmento de ADN.
Una consecuencia inmediata de la clonación molecular es que permite disponer de cantidades ilimitadas de segmento específicos de ADN. Debido a que el ADN pasajero se encuentra formando parte de un plasmido, es factible separarlo fácilmente del resto del ADN celular, que se encuentra en el cromosoma bacteriano, una molécula mucho más grande. A partir de un cultivo de E.coli, se puede separar suficiente ADN plasmídico para caracterizarlo. Una vez que se dispuso de genes individuales purificados, el escenario estaba listo para la siguiente etapa.
Una consecuencia inmediata de la clonación molecular es que permite disponer de cantidades ilimitadas de segmento específicos de ADN. Debido a que el ADN pasajero se encuentra formando parte de un plasmido, es factible separarlo fácilmente del resto del ADN celular, que se encuentra en el cromosoma bacteriano, una molécula mucho más grande. A partir de un cultivo de E.coli, se puede separar suficiente ADN plasmídico para caracterizarlo. Una vez que se dispuso de genes individuales purificados, el escenario estaba listo para la siguiente etapa.
Procedimiento para obtener la secuencia del ADN:
A partir de un gen donado se pueden seguir hoy en día diversos procedimientos para deducir su secuencia nucleotídica. Hasta hora se han empleado casi exclusivamente, los métodos de Maxam-Gilbert y el de Sanger; los cuales tienen en común generar una colección de fragmentos con un extremo común y el otro termina en una de las cuatro bases. En el método de Maxam- Gilbert se utilizan reacciones químicas específicas para lograr este objetivo. En el método de Sanger se emplean reacciones enzimáticas.
El método enzimático.DIDESOXI
A partir de un oligo marcado inicia una reacción de replicación in Vitro. Esta reacción procede hasta encontrar un nucleótido terminador, que no permite que la cadena replicada siga creciendo. Se efectúan cuatro reacciones, una para cada base de ADN que contiene el nucleótido terminador correspondiente, y se termina con cuatro colecciones de fragmentos marcados, cada una constituida por fragmentos que terminan en A, G, C, T respectivamente.
El análisis del tamaño de estos fragmentos, mediante electroforesis en gel, revela de inmediato un patrón de bandas, que corresponde directamente a la secuencia que se encuentra enfrente del oligo iniciador.
Los dos protocolo clásicos de secuenciación (métodos químico y enzimático) comparten etapas comunes.
Marcado: es necesario marcar las moléculas a secuenciar radiactiva o fluorescentemente.
Separación: cada protocolo genera una serie de cadenas sencillas de ADN marcadas cuyos tamaños se diferencian en una única base. Estas cadenas de distintas longitudes pueden separarse por electroforesis en geles desnaturalizantes de archilamida-bisacrilamida-urea, donde aparecen como una escalera de bandas cuya longitud varía en un único nucleótido.
EL MÈTODO QUÌMICO
Para obtener estas cadenas se emplean dos procedimientos:
Originalmente descrito por A. Maxam y W. Gilbert en 1977.
Esta técnica consiste en romper cadenas de ADN de cadena sencilla marcadas radiactivamente con reacciones químicas específicas para cada una de las cuatro bases. Los productos de estas cuatro reacciones se resuelven, por electroforesis, en función de su tamaño en geles de poliacrilamida donde la secuencia puede leerse en base al patrón de bandas radiactivas obtenidas.
Secuenciación de ADN
Es un conjunto de métodos y técnicas bioquímicas cuya finalidad es la determinación del orden de los nucleótidos (A, C, G y T) en un oligonucleótido de ADN. La secuencia de ADN constituye la información genética heredable del núcleo celular, los plasmidos, la mitocondria y cloroplastos que forman la base de los programas de desarrollo de los seres vivos.
Método automático empleando el método enzimático:
Originalmente descrito por A. Maxam y W. Gilbert en 1977.
Esta técnica consiste en romper cadenas de ADN de cadena sencilla marcadas radiactivamente con reacciones químicas específicas para cada una de las cuatro bases. Los productos de estas cuatro reacciones se resuelven, por electroforesis, en función de su tamaño en geles de poliacrilamida donde la secuencia puede leerse en base al patrón de bandas radiactivas obtenidas.
Secuenciación de ADN
Es un conjunto de métodos y técnicas bioquímicas cuya finalidad es la determinación del orden de los nucleótidos (A, C, G y T) en un oligonucleótido de ADN. La secuencia de ADN constituye la información genética heredable del núcleo celular, los plasmidos, la mitocondria y cloroplastos que forman la base de los programas de desarrollo de los seres vivos.
Método automático empleando el método enzimático:
Es una alternativa del método de sanger .Consiste en marcar el oligo cebador o los terminadores con un compuesto fluorescente y activar las reacciones de secuenciación. Los productos de la reacción se detectan directamente durante la electroforesis al pasar por delante de un láser que al excitar los fluoroforos permiten detectar la fluorescencia emitida. Se realiza cuatro reacciones de secuencia distintas en cada una de las cuales se añade el oligomarcador o cebador marcado con una sonda distinta.
Método del escopetazo:
Este método consiste en romper todo el ADN de un genoma, luego secuencia estos fragmentos y por ultimo con poderosos medios informáticos se ensambla la secuencia, los algoritmo para ensamblar la secuencia fueron diseñado por Gen Myers.
Estos métodos han sido utilizados con mucho éxito para secuenciar el genoma humano y el genoma de la mosca de la fruta.
Aplicación de la Secuenciación:
Detección de Mutaciones.
Secuenciación de ADNs fósiles.
Diagnóstico de enfermedades genéticas.
Identificación de especies y control de cruces entre animales.
Proyecto Genoma Humano.
CONCLUSIÓN
El análisis más detallado de la estructura del ADN consiste en averiguar la secuencia de nucleótidos. A lo largo del tiempo se han desarrollado diferentes métodos para obtener la secuencia de nucleótidos del ADN, sin embargo, actualmente los métodos más utilizados son el de secuenciación automática y el método enzimático de terminación de cadena de Sanger también conocido por el método didesoxi.
BIBLIOGRAFÍA
http://images.google.com/imgres?imgurl=http://www.ucm.es/info/genetica/AVG/practicas/secuencia/Automat1.jpg&imgrefurl=http://www.ucm.es/info/genetica/AVG/practicas/secuencia/Secuencia.htm&h=511&w=535&sz=113&hl=es&start=1&um=1&usg=__1uw7oh329A3eU9we_JTSqeeQJV8=&tbnid=G0uZSVCwzhgdqM:&tbnh=126&tbnw=132&prev=/images%3Fq%3Dsecuenciacion%26um%3D1%26hl%3Des%26lr%3Dlang_es%26sa%3DN
http://images.google.com/imgres?imgurl=http://www.ibmb.csic.es/serveis/seq/1small.GIF&imgrefurl=http://www.ibmb.csic.es/serveis/seq/index.html&h=303&w=289&sz=55&hl=es&start=2&um=1&usg=__bI6niGzQruda3exlJr8GsxACWUk=&tbnid=uiNOoTzmsxd6cM:&tbnh=116&tbnw=111&prev=/images%3Fq%3Dsecuenciacion%26um%3D1%26hl%3Des%26lr%3Dlang_es%26sa%3DN
